Hmotnostní spektrometrie

Rozbalit box

Obsah boxu

Šablona:Infobox Vědecká metoda Hmotnostní spektrometrie (často zkracováno jako MS z anglického Mass Spectrometry) je vysoce citlivá a přesná analytická technika, která slouží k měření poměru hmotnosti a náboje (m/z) iontů. Výsledkem měření je hmotnostní spektrum, které zobrazuje relativní zastoupení (intenzitu) detekovaných iontů v závislosti na jejich m/z poměru. Tato metoda umožňuje určit molekulovou hmotnost a chemický vzorec analyzované látky, identifikovat neznámé sloučeniny, stanovit jejich koncentraci a objasnit jejich chemickou strukturu. Díky své univerzálnosti a citlivosti našla hmotnostní spektrometrie uplatnění v širokém spektru vědních oborů, od chemie a biologie přes medicínu a farmacii až po geologii a vědy o životním prostředí.

📜 Historie

Kořeny hmotnostní spektrometrie sahají na konec 19. století, kdy se vědci zabývali studiem katodových a kanálových paprsků.

🏛️ Průkopnické objevy

Za otce hmotnostní spektrometrie je považován britský fyzik Joseph John Thomson, který v roce 1897 objevil elektron a jako první změřil poměr jeho náboje k hmotnosti. V roce 1912 se svým asistentem Francisem Williamem Astonem zkonstruoval první přístroj, který nazval parabolický spektrograf. Tento přístroj dokázal odklánět svazek iontů v elektrickém a magnetickém poli a zaznamenávat jejich dráhy na fotografickou desku. Pomocí tohoto zařízení Thomson prokázal existenci izotopů u neradioaktivního prvku, konkrétně neonu.

Francis W. Aston, nositel Nobelovy ceny za chemii za rok 1922, Thomsonův přístroj výrazně vylepšil a zkonstruoval první skutečný hmotnostní spektrograf s vyšším rozlišením. S jeho pomocí přesně změřil hmotnosti izotopů mnoha prvků a formuloval tzv. pravidlo celých čísel, které říká, že atomové hmotnosti izotopů jsou přibližně celočíselnými násobky hmotnosti protonu.

⚙️ Moderní vývoj

Během 20. století prošla hmotnostní spektrometrie bouřlivým vývojem. Byly vyvinuty nové typy iontových zdrojů, hmotnostních analyzátorů a detektorů, což vedlo k výraznému zvýšení citlivosti, rozlišení a rychlosti analýzy. Klíčovými milníky byly:

**40. léta:** Vývoj hmotnostního analyzátoru s magnetickým sektorem.
**50. léta:** Vynález kvadrupólového hmotnostního analyzátoru (Wolfgang Paul, Nobelova cena za fyziku 1989) a analyzátoru doby letu (TOF).
**60. léta:** Spojení hmotnostní spektrometrie s plynovou chromatografií (GC-MS), což znamenalo revoluci v analýze komplexních směsí.
**80. léta:** Vývoj "měkkých" ionizačních technik, jako je elektrosprejová ionizace (ESI, John Bennett Fenn) a matricí asistovaná laserová desorpce/ionizace (MALDI, Kóiči Tanaka), které umožnily analýzu velkých a křehkých biomolekul, jako jsou proteiny a DNA. Za tyto objevy byla udělena Nobelova cena za chemii v roce 2002.
**Po roce 2000:** Rozvoj hybridních přístrojů (např. Q-TOF) a analyzátorů s ultra vysokým rozlišením, jako je Orbitrap a Fourierova transformační iontová cyklotronová rezonance (FT-ICR).

⚙️ Princip metody

Každý hmotnostní spektrometr se skládá ze tří základních částí, které pracují ve vysokém vakuu, aby se zabránilo srážkám iontů s molekulami vzduchu:

Iontový zdroj: Převede molekuly vzorku na plynné ionty.
Hmotnostní analyzátor: Rozdělí ionty podle jejich poměru hmotnosti k náboji (m/z).
Detektor: Zaznamená počet iontů pro každou hodnotu m/z a převede tento signál na hmotnostní spektrum.

1. Ionizace

Ionizace je klíčovým krokem, při kterém jsou z neutrálních molekul analytu vytvořeny ionty. Volba ionizační techniky závisí na povaze vzorku (těkavost, polarita, termální stabilita) a požadované informaci.

Tvrdé ionizační techniky: Dodávají molekule velké množství energie, což vede k její rozsáhlé fragmentaci. Poskytují informace o struktuře molekuly.

   *   **Elektronová ionizace (EI):** Nejstarší a stále velmi rozšířená technika. Molekuly v plynné fázi jsou bombardovány svazkem elektronů s vysokou energií (typicky 70 eV). Vhodná pro relativně malé, těkavé a termicky stabilní molekuly.

Měkké ionizační techniky: Předávají molekule jen malé množství energie, takže dochází k minimální nebo žádné fragmentaci. V hmotnostním spektru je tak dominantní signál molekulového iontu, což umožňuje snadné určení molekulové hmotnosti.

   *   **Elektrosprejová ionizace (ESI):** Ideální pro polární, termicky labilní a velké molekuly (např. peptidy, proteiny, nukleové kyseliny). Roztok vzorku je rozprašován z kapiláry pod vysokým napětím, čímž vznikají nabité kapičky, z nichž se postupně odpařuje rozpouštědlo, až zůstanou jen plynné ionty analytu.
   *   **Matricí asistovaná laserová desorpce/ionizace (MALDI):** Používá se pro analýzu velmi velkých molekul (proteiny, polymery, dendrimery). Vzorek je smíchán s nadbytkem látky zvané matrice a nanesen na destičku. Krátký pulz laserového záření způsobí desorpci a ionizaci molekul vzorku, které jsou přeneseny do plynné fáze.
   *   **Chemická ionizace (CI):** Měkčí varianta EI. V iontovém zdroji je přítomen v nadbytku reakční plyn (např. methan, amoniak), který je primárně ionizován. Tyto ionty pak reagují s molekulami analytu a ionizují je prostřednictvím přenosu protonu nebo adicí.

2. Hmotnostní analýza

Hmotnostní analyzátor je srdcem spektrometru. Jeho úkolem je "zvážit" ionty, tedy oddělit je na základě jejich poměru m/z.

Kvadrupólový analyzátor (Q): Skládá se ze čtyř paralelních tyčí, na které je přivedeno kombinované stejnosměrné a střídavé elektrické pole. Pro dané nastavení pole mohou analyzátorem projít pouze ionty o specifickém m/z poměru; ostatní jsou vychýleny a nedopadnou na detektor. Je relativně levný a robustní.
Analyzátor doby letu (TOF - Time-of-Flight): Všechny ionty jsou urychleny stejným elektrickým polem a vneseny do prostoru bez pole (letová trubice). Lehčí ionty letí rychleji a dorazí k detektoru dříve než těžší ionty. Měřením doby letu lze určit jejich m/z. TOF analyzátory se vyznačují vysokou rychlostí a teoreticky neomezeným hmotnostním rozsahem.
Iontová past (IT - Ion Trap): Funguje na podobném principu jako kvadrupól, ale ionty jsou zachyceny a skladovány v trojrozměrném elektrickém poli. Postupnou změnou pole jsou ionty selektivně uvolňovány a posílány na detektor. Umožňuje provádět vícenásobné fragmentační experimenty (MSⁿ).
Orbitrap: Moderní typ analyzátoru s extrémně vysokým rozlišením a přesností hmoty. Ionty jsou zachyceny v elektrickém poli a krouží kolem centrální elektrody. Frekvence jejich axiálního pohybu je závislá na jejich m/z a je detekována jako obrazový proud, který je následně pomocí Fourierova transformace převeden na hmotnostní spektrum.
Analyzátor s magnetickým sektorem (B): Využívá silné magnetické pole k zakřivení dráhy letu iontů. Míra zakřivení závisí na hybnosti a náboji iontu, což umožňuje jejich oddělení podle m/z.

3. Detekce

Detektor převádí proud dopadajících iontů na měřitelný elektrický signál. Nejběžnějším typem je elektronový násobič, kde dopadající iont uvolní z povrchu elektrody několik elektronů. Tyto elektrony jsou následně urychlovány a dopadají na další elektrody, čímž se lavinovitě násobí jejich počet. Výsledný zesílený proud je pak zaznamenán.

📊 Výstup a interpretace

Výstupem z hmotnostního spektrometru je hmotnostní spektrum. Jedná se o graf, kde na vodorovné ose (x) je vynesen poměr hmotnosti a náboje (m/z) a na svislé ose (y) je relativní intenzita (zastoupení) iontů.

Molekulový ion (M^+•): Ion, který vznikne z molekuly odebráním jednoho elektronu (při EI). Jeho m/z hodnota odpovídá molekulové hmotnosti původní sloučeniny.
Fragmentové ionty: Menší nabité částice, které vznikají rozpadem (fragmentací) molekulového iontu. Způsob fragmentace je pro danou strukturu charakteristický a slouží jako "otisk prstu" molekuly, což pomáhá při její identifikaci.
Izotopové píky: Většina prvků se v přírodě vyskytuje jako směs několika izotopů. Například uhlík existuje jako ¹²C (cca 98.9 %) a ¹³C (cca 1.1 %). V hmotnostním spektru se proto vedle píku molekulového iontu (obsahujícího jen ¹²C) objeví i menší pík při hodnotě M+1 (obsahující jeden atom ¹³C). Relativní intenzity těchto izotopových píků pomáhají určit elementární složení látky.

🔬 Aplikace a využití

Hmotnostní spektrometrie je nepostradatelným nástrojem v mnoha oblastech:

Proteomika a metabolomika: Identifikace a kvantifikace proteinů a metabolitů v biologických vzorcích, hledání biomarkerů nemocí.
Farmaceutický průmysl: Kontrola kvality léčiv, studium metabolismu léků, vývoj nových léčiv.
Klinická diagnostika: Screening novorozeneckých metabolických poruch, toxikologická analýza.
Environmentální analýza: Detekce a monitorování znečišťujících látek (např. pesticidy, dioxiny) ve vodě, půdě a vzduchu.
Forenzní věda: Identifikace drog, jedů, výbušnin a analýza stop na místě činu.
Potravinářství: Kontrola kvality a bezpečnosti potravin, detekce kontaminantů a falšování.
Geologie a kosmochemie: Určování stáří hornin (izotopové datování), analýza složení meteoritů a planetárních atmosfér.
Dopingová kontrola: Detekce zakázaných látek v tělních tekutinách sportovců.

🔗 Související techniky

Pro analýzu komplexních směsí se hmotnostní spektrometrie často kombinuje s jinými separačními technikami.

Tandemová hmotnostní spektrometrie (MS/MS nebo MSⁿ): Technika, při které jsou vybrané ionty (prekurzory) izolovány v prvním hmotnostním analyzátoru, následně fragmentovány (např. srážkou s inertním plynem) a vzniklé fragmenty (produkty) jsou analyzovány ve druhém hmotnostním analyzátoru. To poskytuje detailní strukturní informace.
Spojení s chromatografií:

   *   **GC-MS (Plynová chromatografie-hmotnostní spektrometrie): Ideální pro analýzu těkavých a termicky stabilních látek. Plynový chromatograf nejprve rozdělí složky směsi, které pak postupně vstupují do hmotnostního spektrometru k identifikaci.
   *   **LC-MS (Kapalinová chromatografie-hmotnostní spektrometrie): Univerzální technika pro analýzu širokého spektra látek, zejména těch, které nejsou těkavé nebo jsou termicky labilní (např. léčiva, peptidy). Kapalinový chromatograf separuje složky, které jsou následně ionizovány (typicky pomocí ESI) a analyzovány.

💡 Pro laiky: Jak to funguje?

Představte si, že máte pytel plný různých míčků (pingpongové, tenisové, golfové, bowlingové koule) a chcete je roztřídit podle jejich hmotnosti. Hmotnostní spektrometrie funguje na podobném principu, ale s molekulami.

1. Nabíjení (Ionizace): Nejprve musíme všechny míčky "zmagnetizovat", aby reagovaly na magnetické pole. V našem případě dáme molekulám elektrický náboj – uděláme z nich ionty. 2. Třídění (Analýza): Nyní všechny nabité míčky vystřelíme stejnou počáteční silou do prostoru, kde fouká silný boční vítr (to je naše elektrické nebo magnetické pole).

   *   Lehké pingpongové míčky (molekuly s nízkou hmotností) vítr snadno odfoukne a jejich dráha se hodně zakřiví.
   *   Těžší tenisové a golfové míčky poletí o něco rovněji.
   *   Nejtěžší bowlingové koule (molekuly s vysokou hmotností) vítr téměř neovlivní a poletí skoro rovně.

3. Počítání (Detekce): Na konci dráhy máme zástěnu s řadou přihrádek. Podle toho, do které přihrádky míček dopadne, víme, jak moc ho vítr odklonil, a tedy jakou má hmotnost. Detektor pak spočítá, kolik míčků každého druhu do přihrádek dopadlo.

Výsledkem je graf, který nám ukáže: "Máš tam 100 pingpongových míčků, 50 tenisáků a 5 bowlingových koulí." Hmotnostní spektrometr tak dokáže neuvěřitelně přesně "zvážit" a spočítat jednotlivé molekuly ve vzorku.

Šablona:Aktualizováno